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iTRAQ技术常见问题与答疑
2016.01.18   点击2652次

1、什么是iTRAQ?
    iTRAQ技术,即同位素相对标记与绝对定量技术。该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性。由于其能够同时对多达8种样品进行标记分析,故在生命科学的各个领域得到了广泛的应用。
2、iTRAQ的原理是什么?
    iTRAQ的检测可以做这样的比喻,蛋白被打成肽段后,被平均的铺在了一个有384个孔的平板上,然后机器会从每个孔中选取浓度在前5名的蛋白进行鉴定和比对,所以,如果假设每个一个样本中有100个蛋白,他们的浓度均为1%,那么得到的结果就是蛋白的得分低,但是鉴定的蛋白数量会很多,可以达到90以上;如果一个样本中有100个蛋白,有3个蛋白的含量分别为30、20、10、其他的97钟蛋白为剩下的50%,那么这三种蛋白的得分高,但是鉴定出的蛋白数量会比较少,也许只有50或者60个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中,抑制了其他蛋白的检出效果。
3、iTRAQ的主要优势有哪些?
    (1) 高通量
    一次性定性和定量该样本的总蛋白,不用像双向电泳(2DE)或DIGE要逐个斑点做鉴定;2DE可分离1500-2500个斑点(并且可能很多斑点对应同一种蛋白),而iTRAQ一般可鉴定2000种以上蛋白,其中常规动物组织或细胞可鉴定到4000-7000种蛋白;
    (2) 结果直观、分析灵活
    直接得到蛋白的定性和相对定量信息,可利用统计学方法快速筛选出各个组别的差异蛋白;能更好的结合基因组或转录组的数据,十分有利于后续研究。
    (3) 对样本类型无限制
    任何类型的样本均可做,当然数据库越全、鉴定到的蛋白种类越多;对于罕见物种,可提供转录组数据来检索,更容易找到有意义的蛋白。
    (4) 加了数据的可靠性和相关性
    一次上机的样本数高达8个,如果样本数多于8个,还可以在每次上机时设置内参,每个样本先跟内参比较,再相互比较(排除操作、环境和仪器误差),从而实现多组样本间的差异蛋白分析。
4、iTRAQ与其他蛋白质组学技术的区别是什么?
    双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术,适用于大部分样本,只是对强酸或强碱性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好;另外由于各个样本需要单独跑胶,很难避免操作误差对结果的影响,可能导致定量不准确;但是双向电泳的服务价格相对便宜,可以用于样本差异的初步筛选;
    DIGE在双向电泳基础上做了改进,引入了荧光标记物和内标,可以使定量更加准确;但该技术也是依据蛋白的等电点和分子量分离,因此对强酸或强碱性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果也不好。
    iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液质联用技术来寻找差异蛋白。其中,iTRAQ和TMT的原理和检测方法基本一致,只是使用了不同的标记物;TMT有10种标记物,可对多达10种不同样本进行分析,但是由于其标记物的质量数非常相近,因此必须使用超高分辨率的质谱才可以满足检测,这也必然会导致信号干扰更多,可能会影响定量的准确性;label-free是非标记的蛋白质组学技术,由于没有标记物,其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性,该技术鉴定到的蛋白数目会少于iTRAQ技术,并且定量的准确性较差,优势是服务费用较低;SILAC是基于稳定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法,利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞,达到体内标记的目的,其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高;但是由于缺乏合适的同位素培养基,该方法基本只能用于可传代的哺乳动物细胞系。
从定量准确性、应用性等各方面综合考虑, iTRAQ技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学技术。
5、iTRAQ实验对样本有何要求?
    任何类型的样本都可以,如果是罕见物种,可以用近缘物种的数据库检索,也可提供转录组数据库来检索;一次上机,每组样本需要用200μg蛋白,但由于需要蛋白定量检测和预实验,因此每组样本所需的蛋白量大概在500μg左右;我公司负责蛋白质的提取,客户只需要提供足够的原始样本。
6、不同类型的样本做iTRAQ能否一次上机?
    不能。如果样品来源于不同物种,检索时就无法选择数据库,也就无法分析数据;即使是同一物种的样本,它们的蛋白种类和丰度也可能有很大差别(比如植物的根和叶),将这些酶切肽段混合上机,其数据会相互干扰,导致蛋白定性和定量的不准确。
7、iTRAQ实验是否需要设置重复?
    通常重复包括生物学重复和技术重复,iTRAQ中常说到的还有上机重复;生物学重复即样本重复,采集来源于同一组别的不同样本(例如同样处理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等),通常设置3个生物学重复,但临床样本一般要求生物学重复更多(如疾病组和健康组各十几例样本);当生物学重复的样本很多时,可以将同组样本混合后再标记,便可以通过一次上机检测;技术重复,通常是同一个样本用不同标记物标记,这样可以排除因蛋白提取、酶解、标记等操作引入的误差;另外iTRAQ实验有时会设计上机重复,这其实也属于技术重复的范畴,即相同的样本上两次机,来排除操作误差和仪器误差。目前发SCI论文一般需要设置重复(无论何种重复),否则可能会被质疑数据的准确性;另外从数据质量上讲,重复能更有效的帮助我们排除不可信蛋白,无论是对WB验证还是后续研究,都是很有利的。
8、iTRAQ的重复性好不好?
    iTRAQ重复性通常是指定量的重复性,即同样的样本在上机两次时得到的结果是否一致;iTRAQ实验重复性的好坏就决定了数据的准确性。一般来说,由于质谱选取肽段的随机性,可能导致检测到的肽段及其强度不同,在经过软件匹配分析后,得到的蛋白比值可能会不一样。一般得分和比值比较靠后的蛋白才会出现定量的严重偏差,而绝大部分蛋白的比值趋势是一致的。因此在分析时,我们会将鉴定到的蛋白先按FDR(错误发现率)或unused值进行筛选,选取置信度大于95%(unused>1.3)或99%(unused>2)的蛋白作为可信蛋白,再进行分析。
9、按什么标准来选取差异蛋白?
    差异蛋白的选取目前并没有统一标准,有多种选择方法,根据比值筛选,结合比值和标准差筛选,或根据T-Test筛选;我们目前一般根据比值进行选择,即差异倍数≤0.67和≥1.5,有时也会按照p≤0.05的标准过滤。
10、iTRAQ实验的数据采用不同数据库检索时,各组间的比值为何是不同的?
    iTRAQ技术中不同标记物之间的比值与检索数据库、质谱电信号的噪音以及采集质谱时的随机性都有关。所以在使用不同数据库检索时,由于匹配肽段情况的不同,定量结果也有些许差异,但是总体变化趋势应是一致的。
11、检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质?
    因为一个蛋白家族中常常含有多个同源性很高的蛋白质,这些蛋白质被酶切之后,很可能会产生很多相同的肽段,软件在进行定性分析时,就会将这些肽段均归于得分最高的那种蛋白质,其他同源蛋白不计分,并且这些同源蛋白都采用同一编号。
12、LC/MS中蛋白处理是定量还是定性?
    这是属于定量,需在蛋白定量后,各取相同量(50-100μg)的蛋白(体积不大于25μl,少于25μl的用专用裂解液补至25μl)进行还原化和烷基化。 
13、LC/MS对需要检测的蛋白有量的要求吗? 
    有。要求蛋白量最低50μg,浓度最低要为5μg/μL,否则同位素无法标记。
14、数据分析中主要看哪些参数?
    对于液质联用的数据分析,一般观察的参数为:Total Ion Score C.I. %(可信度)和Tag-80/Tag-0(两样本的比值)。 
15、众多可信度数值中,主要选择哪些进行研究? 
    一般来说可信度在80%以上的均为可信程度非常高的。有些蛋白可信度在60%以上的也可以作为参考数据。 
16、可信程度低于80%的数据有意义吗?
    可信程度低于此值的,如果有感兴趣的蛋白可以通过ELISA、WB、Q-PCR、液态芯片等技术手段进一步验证,毕竟LC/MS是研究蛋白组学的方法之一,如全面研究还是要综合各种研究方法。
17、两样本的比值都代表什么? 
    两样本的比值如果在0.9-1.1之间的,可以认为两样本的含量是一样的,即比值为1:1;而小于0.9或大于1.1均可认为两样本之间的比值是有差异的。
18、质谱图中显示的是各种蛋白吗? 
    不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱,由于质谱法是电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出的是离子的准确质量,由此来确定离子的化合物组成。

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